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Jun 27, 2023

Nature Microbiology volume 7, páginas 1376–1389 (2022)Cite este artigo

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A variante SARS-CoV-2 Omicron tem níveis de transmissão muito elevados, é resistente à neutralização por anticorpos monoclonais humanos terapêuticos autorizados (mAb) e é menos sensível à imunidade mediada por vacina. Para fornecer terapias adicionais contra Omicron, isolamos um mAb denominado P2G3 de um doador vacinado previamente infectado e mostramos que ele possui atividade neutralizante na faixa picomolar contra Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 e todas as outras variantes testadas. Resolvemos a estrutura do Fab P2G3 em complexo com o pico Omicron usando microscopia crioeletrônica com resolução de 3,04 Å para identificar o epítopo P2G3 como um mAb de Classe 3 que é diferente dos epítopos de pico de ligação ao mAb relatados anteriormente. Utilizando um modelo de desafio de macaco SARS-CoV-2 Omicron, mostramos que P2G3 sozinho, ou em combinação com P5C3 (um mAb de Classe 1 amplamente ativo previamente identificado), confere proteção profilática ou terapêutica completa. Embora pudéssemos selecionar mutantes SARS-CoV-2 que escaparam da neutralização por P2G3 ou por P5C3 in vitro, eles tinham baixa infectividade e mutações de “escape” são extremamente raras em bancos de dados de sequências públicas. Concluímos que esta combinação de mAbs tem potencial como medicamento anti-Omicron.

O SARS-CoV-2 é responsável por >340 milhões de infecções confirmadas e >5,5 milhões de mortes em todo o mundo1. Sua propagação resultou no surgimento de variantes preocupantes (VOC) que são mais transmissíveis e resistentes às respostas imunológicas. Predominam VOCs que abrigam um grande número de mutações em comparação com a cepa SARS-CoV-2 original, com Delta (B.1.617.2) e suas 11 a 15 mutações de pico agora amplamente substituídas pela variante Omicron altamente infecciosa (B.1.1.529.1 ), que contém até 37 mutações de aminoácidos na proteína spike2,3. Quinze das substituições de pico no Omicron estão no domínio de ligação ao receptor (RBD), a região alvo de anticorpos neutralizantes (sejam induzidos por infecção ou vacinas atuais) que foram todos criados contra a cepa original de 2019-nCoV Wuhan4,5,6,7 ,8. Omicron também resiste à neutralização pela maioria dos mAbs anti-SARS-CoV-2 relatados até agora9,10,11,12,13,14,15 e agora está circulando como várias subvariantes, incluindo BA.1.1, BA.2 (B.1.1 .529.2) e BA.3 (B.1.1.529.3)2, criando uma necessidade médica urgente e não atendida tanto de profilaxia como de terapêutica.

Nós rastreamos a presença de anticorpos anti-spike em amostras de soro de uma coorte de >100 doadores e nos concentramos em um doador pós-infectado que recebeu duas doses da vacina mRNA-1273 e tinha um dos mais altos níveis de anticorpos séricos, com excelente amplitude contra um painel de variantes do SARS-CoV-2 em um ensaio de neutralização substituto trimérico de spike-ACE216. A triagem de sobrenadantes de clones de células B para ligação de picos de alta afinidade levou-nos a priorizar seis clones para produção de mAb através da expressão de cadeias pesadas e leves emparelhadas em células ExpiCHO. Durante o perfil inicial desses mAbs purificados, o P2G3 exibiu a afinidade de ligação mais forte para o trímero de espícula 2019-nCoV original e um painel de proteínas de espícula que codificam mutações encontradas em VOCs Alfa, Beta, Gama e Delta (IC50s de 0,006–0,010 µg ml-1 ) (Dados Estendidos Fig. 1a). Estudos de ligação de RBD de pico competitivo cruzado realizados com um painel de mAbs anti-SARS-CoV-2 autorizados ou clinicamente avançados (REGN10933 e REGN10987 da Regeneron17, AZD8895 e AZD1061 da AstraZeneca18, ADG-2 da Adagio19, S309/Sotrovimab da Vir/GSK20 ) e mAbs previamente descritos pelo nosso grupo demonstram que o P2G3 se liga a um epítopo único, embora sobreposto, àqueles reconhecidos tanto pelo AZD1061 quanto pelo S309/Sotrovimab, este último agindo por um mecanismo distinto do bloqueio da interação RBD/ACE2 (Extended Data Fig. 1b). É importante ressaltar que nosso potente e amplamente ativo mAb de Classe 1, P5C3, ligou o RBD de forma não competitiva ao P2G3, levando-nos a traçar o perfil desses mAbs sozinhos e em combinação para estudos subsequentes.

42-fold more potent than ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 and REGN10987 mAbs and 19-fold more potent than Sotrovimab at neutralizing Omicron BA.1 spike-pseudotyped lentiviral particles (Fig. 2b). Second most potent was P5C3, with an IC80 value of 0.223 µg ml−1, and the P2G3/P5C3 combination revealed a minor-enhanced activity over P2G3 alone in this assay, with an IC80 value of 0.024 µg ml−1 for the total concentration of the two mAbs. Furthermore, P2G3 and P5C3 maintained full neutralizing activity against the ancestral D614G and Omicron BA.1.1 encoding the R346K spike pseudovirus (Extended Data Fig. 2a,b), a mutation present in ~10% of Omicron variant sequences in the GISAID11./p>10× less potent than P2G3, P5C3 and both the AZD and REGN cocktails against this virus./p>6.2 µg ml−1 at the time of viral inoculation and P2G3 treatment groups showed a significant ~4-log reduction of genomic viral RNA levels (Extended Data Fig. 4c)./p>1,200 Å2 (Fig. 5b and Extended Data Figs. 7a and 8a). To characterize the P2G3 paratope and epitope interface in detail, we performed local refinement of the P2G3 Fab-RBD interacting region and reached a resolution of 3.84 Å with well-defined density, allowing clear interpretation of sidechain positions (Extended Data Figs. 6 and 8, and Supplementary Fig. 2 and Data Table 1). The P2G3 paratope is composed of four complementarity-determining region (CDR) loops binding at the back of the RBD. The interactions are mediated through electrostatic and hydrophobic contacts (Fig. 5c,d and Extended Data Fig. 8b,c) and involve 16 residues of the RBD, mainly bound by the heavy chain of the P2G3 mAb. The 18-residue-long CDRH3 sits at the top of a loop that comprises residues 344–347, and also contacts the amino acids at the limits of the 5-stranded β-sheet (residues 440–451), overall accounting for >60% of the buried surface area (431 Å2) (Extended Data Fig. 8a–c). The interactions between P2G3 and the Omicron RBD are conserved in both RBD-up and RBD-down states (Extended Data Fig. 8c,d). CDRH2 extends the epitope by interacting with R346 that is engaged by residue W53 via a potential cation-pi interaction (Fig. 5d and Extended Data Fig. 8e), an interaction that is probably conserved with the R346K spike substitution (Extended Data Fig. 2a,b). The only potential contact from the light chain derives from the CDRL1 Y32 forming a hydrophobic interaction with V445 of the RBD (Extended Data Fig. 8c). Moreover, P2G3 is only observed to contact RBD amino acid residues and the distance to the nearest atom of the glycan branch is ~10 Å from P2G3. Importantly, the epitope defined by our structural studies rationalizes the potent neutralizing activity of P2G3 against the Omicron variant relative to other Class 3 mAbs. Omicron mutations S371L, N440K, G446S and the minor R346K sub-variant are all situated outside of, adjacent to or have little effect on recognition of the P2G3-binding epitope, whereas two or more of these mutations directly impinge on epitopes recognized by REGN10987, AZD1061 and S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Furthermore, P2G3 displays a unique binding orientation on the RBD, with its Fab angling away from most of these Omicron mutations (Fig. 5f). In modelling the observed angles of attack of various Class 3 mAbs, it is possible that REGN10987 only binds to the up-RBD form while AZD1061 binds one up- and one down-RBD form, with steric hindrance blocking the third RBD site on the Omicron spike trimer (Extended Data Fig. 9). In contrast, P2G3 and S309/Sotrovimab probably binds both the up and down forms of Omicron RBD without clashes (Fig. 5g and Extended Data Fig. 9c), a characteristic that may contribute to the largely conserved and high potency of P2G3 across VOCs./p>

99% by SDS–PAGE analysis. Biotinylation of spike or RBD proteins was performed using EZ-Link NHS-PEG4-biotin (Life Technologies) with a 3-fold molar excess of reagent following the manufacturer’s protocol. Biotinylated proteins were buffer exchanged with PBS using an Amicon Ultra-0.5 with a 3 kDa molecular weight cut-off. Spike and RBD tetramers were prepared fresh before use and formed by combining biotinylated proteins with PE-conjugated streptavidin (BD Biosciences) at a molar ratio of 4:1./p>100 donors were monitored for levels of IgG antibody binding to the SARS-CoV-2 spike trimer proteins from 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta and Gamma variants in the Luminex bead-based assay./p>

1-log reduction in viral RNA and infectious virus anticipated in the lung tissue with an effective therapy that can provide statistically significant differences between treated and untreated animals. These sample size assumptions were confirmed in our statistical analysis. Statistical differences in viral RNA levels and infectivity were evaluated using the Mann-Whitney two-sided tests to compare control and treatment groups./p>

4000 cells analysed per condition. c, d) Antibody dependent cellular phagocytosis assay performed ancestral 2019-nCoV and with Omicron BA.1 variant Spike protein biotinylated and bound to streptavidin coated fluorescent beads. Beads mixed with the indicated antibody concentrations were incubated with the U937 monocyte effector cell line and antibody dependent cellular phagocytosis of the Spike coated beads was evaluated by flow cytometry. Dashed lines correspond to individual antibodies and solid lines indicate combinations of P2G3 and P5C3. Results shown are representative data for three separate experiments with each concentration response tested in duplicates or triplicates. Mean values ± SEM are shown./p>

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